بررسی تشخیص عوامل اصلی باکتریایی اندومتریت پس از زایش به روش multiplex PCR در گاوهای …

مطالعهای سه باکتری Staphylococcus aureus، Escherichia coli و Bacillus cereus با روش multiplex PCR شناسایی شدند (Sun et al. 2011). به کار گیری روش multiplex PCR سبب سهولت و افزایش سرعت انجام کار و هزینه کمتر نسبت به روش استاندارد میشود (Tramuta et al. 2011). علاوه بر حساسیت بالا، فواید دیگری نیز برای واکنش زنجیرهای چندتایی وجود دارد از جمله کارایی در شناسایی باکتریهای مرده و امکان استفاده از آن در نمونههای بایگانی و یا آنها که با روشهای پاتولوژی ماندگار شدهاند (Preziuso and Cuteri 2012).
فصل سوم
روش کار
۳-۱- انتخاب حیوانات
این مطالعه در یک گاوداری صنعتی بزرگ نزدیک شیراز واقع در استان فارس انجام شد. ۱۷۷ راس گاو شیری جوان (شکم اول و دوم) دو بار مورد معاینه قرار گرفتند، ۲۵ تا ۳۵ روز پس از زایمان (Drillich 2006; Yavari et al. 2007) و دو هفته پس از آن (۳۹ تا ۴۹ روز پس از زایش). در گاوداری ۱۹۰۰ راس گاو نژاد هولشتاین سه بار در روز دوشیده میشدند. گاوها در جایگاه فریاستال با بستر مت (mat) برای گاوهای شکم اول و بستر ماسه برای گاوهای چند شکم زاییده جای داده شده بودند. متوسط سالانه تولید شیر هر گاو بیش از ۹۰۰۰ لیتر بود. گاوها با یونجه خشک، سیلوی ذرت و کنسانتره (شامل دانه ذرت و جو، کنجاله سویا، سبوس گندم، ویتامینها و مواد معدنی) تغذیه میشدند. گاوها سه هفته پیش از زایش در گروه جداگانه نگهداری میشدند و زایش آنها در جایگاه گروهی باز انجام میگرفت. گاوهای تازهزا به مدت یک ماه در گروه انتقالی نگهداری میشدند. هیچ یک از گاوها حداقل ۱۴ روز قبل از نمونه گیری هیچگونه هورمون یا آنتیبیوتیک عمومی یا داخل رحمی دریافت نکرده بودند. جمعآوری نمونهها در نخستین معاینه از ۱۷۲ راس گاو و در دومین معاینه از ۱۲۸ راس در زمستان
سالهای ۱۳۸۹ و ۱۳۹۰ انجام گرفت. بعد از معاینه، درمان معمول گاوداری (پروستاگلاندین F2α و اکسیتتراسایکلین) برای گاوهای با اندومتریت بالینی تجویز میشد.
۳-۲- معاینات بالینی
گاوها معاینه بالینی شدند و از نظر وجود ترشحات چرکی در ناحیه مهبل، پرینه و اطراف دم بررسی و اختلالات احتمالی ثبت شد. همچنین وضعیت بدنی گاوهای مورد مطالعه (بر مبنای درجه بندی ۱ تا ۵) در زمان معاینه اول و معاینه دوم ثبت شد. به منظور کاهش خطا در تشخیص نمره مربوط به وضعیت بدنی از نظر دو فرد به این منظور استفاده شد.
بررسی دستگاه تناسلی داخلی از طریق لمس راست رودهای و دستگاه اولترا سونوگرافی (Easy-Scan, BCF, Scotland) با پروب ۵ مگاهرتز انجام شد (Barlund et al. 2008; Mateus et al. 2002; Oral et al. 2009; Drillich 2006; Kasimanickam et al. 2004; Lewis 1997). قطر گردن رحم، محل قرارگیری رحم، تقارن شاخهای رحم و قطر شاخهای رحم، قوام دیواره و وجود لومن رحم، بافت و ضخامت دیواره رحم، تجمع مایعات درون رحم، ساختارهای تخمدانی شامل جسم زرد، فولیکول با قطر بیش از ۷ میلیمتر (Lucy 2007) و کیست (ساختار با قطر بیش از ۲۵ میلیمتر) (LeBlanc et al. 2002a) ثبت شدند. وضعیت دستگاه تناسلی و بیماریهای بالینی قابل تشخیص ثبت شدند.
سپس معاینه مهبلی صورت گرفت. برای انجام این کار ناحیه پرینه گاوها توسط یک حوله کاغذی تمیز و خشک شده، توسط محلول ساولن (کلرهگزیدین و ستریمید) تمیز و ضدعفونی میشد. آنگاه توسط دست پوشیده شده با دستکش تمیز و لغزنده به مهبل دسترسی پیدا کرده و ترشحات از دیوارههای پشتی، شکمی و جانبی مهبل جمعآوری شده و بر اساس رنگ و بوی ترشحات، درجه بندی اندومتریت – صفر تا سه- انجام شد. درجه یک: ترشحات تمیز با رگههایی از چرک، درجه دو: ترشحات موکوسی-چرکی با کمتر از ۵۰ درصد چرک، درجه سه: ترشحات موکوسی-چرکی با بیش از ۵۰ درصد چرک و یا با بوی زننده (Williams et al. 2005). سپس گاوها به دو گروه طبقه بندی شدند: سالم (درجه ترشحات مهبلی یک و کمتر) و مبتلا به اندومتریت (درجه ترشحات مهبلی دو و بیشتر) (Dubuc et al. 2010).
۳-۳- تهیه نمونههای سلول شناسی
نمونه سلول شناسی از ترشحات گردن رحم تهیه شد. برای تهیه نمونههای سلول شناسی گردن رحم، ترشحات توسط پیپت پلاستیکی رحمی از دهانه خارجی گردن رحم با کمک سرنگ ۵۰ سیسی به آرامی مکیده شدند (Ahmadi et al. 2007). سپس ترشحات به دست آمده روی اسلایدهای شیشهای منتقل شدند. اسلایدهای گرد آوری شده در دمای معمولی خشک شده و به آزمایشگاه منتقل شدند. رنگ آمیزی اسلایدها به روش گیمسا انجام گرفت. از هر اسلاید، ۱۰۰ تا ۲۰۰ سلول از ۲۰ فیلد میکروسکوپی با بزرگنمایی X900 شمارش شد و درصد نوتروفیلها محاسبه گردید.
۳-۴- جمعآوری نمونههای ترشحات رحمی
جمع آوری نمونه با روش شستوشوی کم حجم رحم (Barlund et al. 2008; Santos et al. 2010) و با استفاده از سرم فیزیولوژی انجام شد. پیپت پلاستیکی غلاف دار استریل برای جمع آوری نمونه رحمی استفاده شد. برای استریل کردن پیپتها، ابتدا به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتیگراد در آتوکلاو قرار داده شدند. سپس با غلافهای پلاستیکی پوشانده شدند و به مدت ۲۰ دقیقه نور UV دریافت کردند تا غلافهای آنها استریل شوند. گاو مهار شده و ناحیه پرینه توسط محلول ساولن (کلرهگزیدین و ستریمید) تمیز و ضدعفونی میشد. پیپت غلاف دار به ناحیه قدامی مهبل هدایت و از قسمت خلفی گردن رحم عبور داده میشد. سپس غلاف پاره شده و سر پیپت استریل از قسمت قدامی گردن رحم عبور داده شده و در بدنه رحم قرار میگرفت. ۶۰ سیسی سرم فیزیولوژی استریل به داخل رحم تزریق شده، به آرامی مالش داده میشد و مایع برگشتی در لولههای یک بار مصرف استریل جمع آوری میشد. حجم مایع جمعآوری شده بین ۱۰ تا ۱۵ سیسی متغیر بود. نمونه ها تا پیش از انتقال به آزمایشگاه در کنار یخ نگهداری میشدند.
۳-۵- استخراج DNA از مایعات رحمی
نمونهها به مدت ۱۰ دقیقه در دور × g ۵۰۰۰ سانتریوفوژ شدند. مایع رویی دور ریخته شد باقیمانده آن به میکروتیوبهای ۲ سیسی انتقال داده شد. از ۲۰۰ میکرولیتر از این مایع با استفاده از کیت (AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit, Bioneer, Daejeon, South Korea) مطابق با دستور شرکت سازنده استخراج DNA صورت گرفت.
۳-۶- تشخیص حضور E. coli، T. pyogenes، F. necrophorumو P. melaninogenicus با PCR
برای همه این باکتریها یک غلظت از واکنش دهندهها آماده شد. ۲۰ میکرولیتر محلول تهیه شد که شامل ۱۰ پیکومول از هر پرایمر (جدول ۱)، ۲۵/۰ میلی مول از هر داکسینوکلئوتید تری فسفات، ۷۵/۰ میلی مول کلرید منیزیم، بافر تگ پلیمراز X1، ۱ واحد آنزیم تگ پلیمراز (پارس توس، مشهد، ایران) و ۴ میکرولیتر از DNA نمونه به عنوان الگو. واکنش زنجیرهای استاندارد برای هر باکتری به صورت جداگانه به شرح زیر انجام شد.
باکتری E. coli: یک چرخه (۹۴ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه)، ۳۰ چرخه (۹۴ درجه سانتیگراد به مدت ۱ دقیقه، ۵۵ درجه سانتیگراد به مدت ۱ دقیقه، ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۱ دقیقه)، یک چرخه (۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه) (Bicalho et al. 2012).
باکتری T. pyogenes: یک چرخه (۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه)، ۳۰ چرخه (۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۱ دقیقه، ۵۶ درجه سانتیگراد به مدت ۱ دقیقه، ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۱ دقیقه)، یک چرخه (۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه) (Silva et al. 2009).
باکتری F. necrophorum: یک چرخه (۹۴ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه)، ۳۰ چرخه (۹۴ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۵۹ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ ثانیه)، یک چرخه (۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه)
(Bennett et al. 2009).
باکتری P. melaninogenicus: یک چرخه (۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه)، ۲۵ چرخه (۹۵ درجه سانتیگراد به مدت ۱۵ ثانیه، ۵۴ درجه سانتیگراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۱ دقیقه)، یک چرخه (۷۲ درجه سانتیگراد به مدت ۵ دقیقه) (Yoshida et al. 2005).

برای دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت  fumi.ir  مراجعه نمایید.

جدول ۱٫ پرایمرهای استفاده شده در شناسایی ژنهای هدف
ژن توالی پرایمر باکتری محصول
(bp)
دمای
اتصال (°C)
منبع