بررسی تشخیص عوامل اصلی باکتریایی اندومتریت پس از زایش به روش multiplex PCR …

۳۸۹

۵۴

Yoshida et al. 2005

سه ژن plo برای سم پیلولازین T. pyogenes، ژن lktA برای لوکوتوکسین F. necrophorum و ژن phyA برای همولایزین P. melaninogenicus منحصر به فرد و اختصاصی بودند. پرایمر ژن ۱۶S rRNA برای شناسایی زیرگروه E. coli متشکل از باکتریهایی چون E. coli، Hafnia alvei و Shigella spp. طراحی شده است.
باکتری E. coli با ATCC شماره ۳۵۲۱۸، باکتری P. melaninogenicus با ATCC شماره ۲۵۸۴۵، و باکتریهای T. pyogenes و F. necrophorum بومی به عنوان کنترل مثبت استفاده شدند. محصولات واکنش زنجیرهای با الکتروفورز روی ژل آگاروز ۱ درصد از هم تفکیک شده و با μg/mL 5/0 اتیدیوم بروماید رنگ آمیزی و تحت نور فرابنفش قابل مشاهده شدند. قرار گرفتن محصول واکنش در اندازه مولکولی مورد انتظار به عنوان نتیجه مثبت در نظر گرفته شد.
۳-۷- واکنش زنجیرهای پلیمراز چندتایی (multiplex PCR) برای باکتریهای E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum
برای انجام واکنش زنجیرهای پلیمراز چندتایی، سه باکتری E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum استفاده شدند. محلول ۴۰ میکرولیتری که برای واکنش ساخته شد شامل مواد زیر بود: ۱۳ پیکومول از هر پرایمر، ۱ میلیمول از هر داکسی نوکلئوتید تری فسفات، ۲ میلی مول کلرید منیزیم، بافر تگ پلیمراز X1، ۴ واحد آنزیم تگ پلیمراز (پارس توس، مشهد، ایران) و ۸ میکرولیتر از DNA نمونه به عنوان الگو.
گرادیانت دمایی ۵۷ تا ۵۹ درجه سانتیگراد برای دمای اتصال استفاده شد و واضحترین باندها در دمای ۵۹ درجه سانتیگراد به دست آمد (تصویر ۲). بعد از تجربه چندین شرایط مختلف، واکنش زنجیرهای پلیمراز چندتایی با شرایط زیر بهینه و انجام شد: ۹۵ درجه سانتیگراد برای ۵ دقیقه، به دنبال آن ۳۰ چرخه ۹۴ درجه سانتیگراد برای ۳۰ ثانیه، ۵۹ درجه سانتیگراد برای ۴۵ ثانیه و ۷۲ درجه سانتیگراد برای ۵۰ ثانیه. از باکتری E. coli با شماره ATCC 35218، و باکتریهای بومی T. pyogenes و F. necrophorum به عنوان الگو استفاده شد.
۳-۸- بررسی شاخصهای تولیدمثلی
پایش حیوانات تا هنگام آبستنی مجدد یا تا روز ۲۴۰ پس از زایش ادامه یافت. تعداد تلقیحها برای آبستن شدن گاو تا حداکثر ۸ ماه پس از زایش، روزهای باز، دریافت درمان مجدد در معاینه دوم به عنوان شاخصهای تولیدمثلی بررسی شدند.
۳-۹- آزمونها و تحلیلهای آماری
تحلیل آماری دادهها با استفاده از نرمافزار SAS 9.1 انجام گرفت. تفاوت در شیوع اندومتریت در اولین معاینه (۲۵ تا ۳۵ روز پس از زایش) با دومین معاینه (دو هفته بعد) و تغییرات آنها با آزمون مربع کای[۲] و تست دقیق فیشر[۳] آزموده شد. ارتباط باکتریهای شناسایی شده در اولین و دومین معاینه، و ارتباط بین نوبت نمونه گیری و شناسایی هر باکتری با آزمون دقیق فیشر تعیین شد. ارتباط بین باکتریهای شناسایی شده توسط آزمون همبستگی مورد تحلیل قرار گرفت. ارتباط ابتلای گاوها به اندومتریت بالینی، آلودگی باکتریایی به صورت کلی یا هریک بتنهایی، قطر گردن رحم، تقارن شاخهای رحم، وجود لومن رحم، ساختار غالب تخمدان با همدیگر و با شاخصهای تولیدمثلی چون گروه بندی تعداد تلقیح و درمان دیگر با آزمون دقیق فیشر تعیین شد. تفاوت در میانگینهای وضعیت بدنی، روزهای باز و درصد نوتروفیلها در سلول شناسی گردن رحم در ابتلا به اندومتریت، آلودگی به باکتریها به صورت کلی یا هر یک بتنهایی، قطر گردن رحم، تقارن شاخهای رحم و وجود لومن رحم، ساختار غالب تخمدان با آزمون میانگین t و یا آزمون یک طرفه ANOVA با تست تعقیبی دانکن استفاده شد. ارتباط آلودگی با باکتریها به طور کلی و هر یک بتنهایی و نیز ساختار تخمدان با روزهای باز، تعداد تلقیح و درمان مجدد با آزمون همبستگی مورد بررسی قرار گرفت. ارتباط بین شاخصهای تولیدمثلی روزهای باز، تعداد تلقیح و درمان مجدد با آزمون همبستگی بررسی شد. در تمامی آزمونها P < 0.05 به عنوان معنیداری مورد توجه قرار گرفت.
گاوها چندین بار به دو گروه تقسیم شدند: PCR مثبت (۱) یا PCR منفی (صفر) برای هر باکتری و برای شکم زایش (شکم اول: ۱ و شکم دوم: صفر). به منظور ارزیابی ارتباط بین حضور باکتریها و شکم زایش با احتمال ابتلا به اندومتریت بالینی، دو مدل رگرسیون لجستیک[۴] چند متغیره روی دادهها انجام شد. متغیر وابسته، اندومتریت بالینی در اولین و دومین معاینه بود. متغیرهای مستقلی که در مدل اولین معاینه استفاده شدند شامل شکم زایش (شکم اول و دوم) و حضور باکتریهای E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum در اولین معاینه بودند. در دومین مدل، که مربوط به معاینه دوم بود، متغیرهای مستقل شامل شکم زایش (شکم اول و دوم) و حضور باکتریهای E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum در اولین و دومین معاینه بود. تمامی واکنشهای متقابل دو طرفه به مدل افزوده شد. معنیداری آماری هنگامی در نظر گرفته شد که P < 0.05 مشاهده میشد.
فصل چهارم
نتایج
در مجموع از ۱۷۷ گاو انتخاب شده، ۳۰۰ نمونه در دو معاینه (۱۷۲ نمونه در معاینه اول و ۱۲۸ نمونه در معاینه دوم) جمع آوری شد. در مطالعه حاضر برای چهار باکتری T. pyogenes، E. coli، F. necrophorum و P. melaninogenicus واکنش زنجیرهای پلیمراز (PCR) استاندارد تنظیم شده و ۳۲ شناسایی مثبت به دست آمد (تصویر ۱). همچنین یک پروتکل multiplex PCR برای سه باکتری بیماریزای اصلی رحم (E. coli، T. pyogenes و F. necrophorum) طراحی شد و واکنش زنجیرهای چند تایی باندهای تکی به ترتیب در اندازههای ۳۴۰، ۲۷۰ و ۴۰۲ جفت باز تولید کرد، که با اندازههای باندهای تولیدی با واکنش زنجیرهای تکی برای نمونهها منطبق بود (تصویر ۲).
۴-۱- معاینه اول
۴-۱-۱- ابتلای به اندومتریت بالینی
ارزیابی ترشحات مهبلی نشان داد که ۶۱ راس از ۱۷۲ گاو (۵/۳۵ درصد) در اولین معاینه (۲۵ تا ۳۵ روز پس از زایش) مبتلا به اندومتریت بالینی (نمره ترشحات مهبلی ۲ و بیشتر) بودهاند (جدول ۲). بین ابتلای گاوها به اندومتریت بالینی و قطر بیشتر گردن رحم (بیشتر از ۵ سانتیمتر)، عدم تقارن شاخهای رحم و وجود لومن رحم ارتباط معنیدار وجود داشت. ابتلای به اندومتریت با ساختار تخمدانی، نیاز به درمان مجدد و تعداد تلقیح ارتباط معنیداری نداشت. میانگین وضعیت بدنی در گاوهای سالم و مبتلا به اندومتریت بالینی تفاوت معنیدار نداشت. هر چند میانگین روزهای باز در گاوهای مبتلا بیشتر بود اما این تفاوت معنادار نبود. درصد نوتروفیلها در سلول شناسی گردن رحم گاوهای مبتلا به اندومتریت بالینی به طور معناداری بیشتر بود (جدول ۳).
۴-۱-۲- باکتری شناسی
در ۱۷ راس از ۱۷۲ گاو، ۲۵ مورد آلودگی باکتریایی به روش PCR شناسایی شدند (جدول ۴)، ۴ گاو برای باکتری E. coli، ۱۱ گاو برای باکتری T. pyogenes و ۱۰ گاو برای باکتری F. necrophorum مثبت بودند که از این تعداد ۸ راس عفونت مشترک با باکتری T. pyogenes داشتند و ارتباط آنها معنیدار بود (جدول ۵).
آلودگی کلی باکتریایی در نمونههای رحمی با ابتلای به اندومتریت بالینی ارتباط معنیدار داشت. ارتباط بین ابتلای به اندومتریت با حضور باکتری T. pyogenes، F. necrophorum و موارد مشترک این دو باکتری معنیدار اما با حضور باکتری E. coli معنیدار نبود. آلودگی کلی باکتریایی نمونههای رحمی یا هریک از باکتریها به تنهایی ارتباط معنیداری با روزهای باز، تعداد تلقیح و دریافت درمان مجدد (جدول ۷)، وضعیت بدنی گاو و ساختار تخمدان نداشت. آلودگی کلی باکتریایی با افزایش قطر گردن رحم و عدم تقارن شاخهای رحم ارتباط داشت اما موجب ایجاد لومن در شاخ رحم نشده بود. آلودگی با T. pyogenes موجب افزایش قطر گردن رحم، عدم تقارن در شاخها و وجود لومن شاخ رحم شده بود. آلودگی با F. necrophorum با افزایش قطر گردن رحم و عدم تقارن در شاخهای آن همراه بود اما با وجود لومن شاخ رحم ارتباطی نداشت. آلودگی مشترک با دو باکتری T. pyogenesis و F. necrophorum با عدم تقارن در شاخهای رحم ارتباط معنیدار داشت اما با افزایش قطر گردن رحم و وجود لومن رحم ارتباطی نداشت. ارتباط معنیدار بین یافتن باکتری E. coli و هیچ کدام از شاخصهای افزایش قطر گردن رحم، عدم تقارن در شاخهای رحم و وجود لومن شاخ رحم وجود نداشت. آلودگی کلی باکتریها و یا هریک از باکتریها به تنهایی تغییر معناداری در میانگین وضعیت بدنی، روزهای باز (جدول ۹) و درصد نوتروفیلها ایجاد نکرده بود (جدول ۱۰).
هیچ نمونه مثبتی از باکتری P. melaninogenicus شناسایی نشد.

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت  ۴۰y.ir  مراجعه نمایید.