جداسازی و تشخیص مولکولی پاراکوویروس های انسانی از نمونه کلینیکی کودکان مبتلا به گاستروانتریت به روش …

از محیط کشت سوش DH5α به کمک لوپ و در کنارشعله سلولها را به ml 10 از LB بدون آنتی بیوتیک که در فالکون
cc50 ریخته شده بود منتقل میکنیم و در داخل انکوباتور°C 37 و روی شیکر با سرعت RPM 250 به مدت یک شبانه
کشت میدهیم. صبح روز بعد µL500 از محیط را برداشته و به ML50 محیط LB بدون آنتی بیوتیک که در داخل ارلن است
منتقل کرده و به مدت ۲ ساعت در °C 37 و روی شیکر با سرعت RPM 250 کشت میدهیم. در این فاصله به منظور
نگهداری طولانی مدت سوش باکتری باقیمانده به روش زیر عمل میکنیم.
*روش نگهداری سوش(Stock ):
به منظور نگهداری طولانی مدت سوش باکتری، باقیمانده محیط کشت (ml 5/9) که در فالکون باقیمانده است، در ۴ درجه با
دورg 1600 به مدت ۱۰ دقیقه سانتریفوژ میکنیم, تا سلولها کاملا ته نشین شوند. سپس با سمپلر محیط کشت را کاملا از
روی سلولها خارج کرده و سپس حدود Lµ ۶۵ محیط تازه روی سلولها ریخته و Lµ ۳۵ گلیسرول (۱۰۰%( اتوکلاو شده به
آن افزوده به آرامی سلولها را مخلوط و با حجمهای مساوی به ده میکروتیوبml 5/1 اتوکلاو شده منتقل کرده، درب آنرا با
پارافیلم محکم بسته و در ۸۰- درجه نگهداری می کنیم.
– OD سلولهای محیط کشت درون ارلن که برای دو ساعت در انکوباتور شیک شده بود را برای اطمینان از رسیدن آنها به فاز
لگاریتمی رشد، بررسی کرده و پس از اطمینان از این موضوع محتوی ارلن را به فالکون ml50 منتقل کرده و به مدت ۱۵
دقیقه بطور کامل در یخ فرو میبریم و سپس در °C 4 با دورg 1600 به مدت ۷ دقیقه سانتریفیوژ میکنیم تا رسوب سلولها
بدست آید. محلول روئی را با سمپلر بطور کامل خالی میکنیم. ‍‍ml 10 cacl2 (100 میلی مولار استریل) به رسوب سلولها
اضافه کرده به آرامی پی پتور میکنیم و به مدت ۳۰ دقیقه بر روی یخ قرار میدهیم. سپس با دور g1100در °C 4 به مدت
۵ دقیقه سانتریفیوژ کرده , و درحالیکه فالکون روی یخ قرار دارد محلول روئی را با سمپلر خارج کرده ومجددا ml10 cacl2
(۱۰۰ میلی مولار استریل) به آن اضافه کرده و به مدت زمان ۳۰ دقیقه بر روی یخ قرار می دهیم . سپس با دور g 1100 در
°C 4 به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ کرده محلول روئی را کاملا خارج میکنیم.انتظار داریم که در این مرحله باکتریها
competent ant شده باشند.
Lµ ۱۶۰۰ از cacl2 (100 میلی مولار استریل)و µL400 گلیسرول (استریل ۱۰۰%) روی یخ به آن اضافه کرده و پی پتور
می کنیم.این µL100 سوسپاتسیون سلولی بطور مساوی به ده میکروتیوب ml 5/1 اتوکلاو شده منتقل شده ، درب آنرا با
پارافیلم محکم بسته و در ۸۰- درجه نگهداری می کنیم.
۳-۶) پروتوکل ترا نسفورم کردن:
دو محیط کشت آگار بدون AMP و ۴ محیط دارای AMP را از داخل یخچال به میز آزمایشگاه منتقل می کنیم تا به دمای
آزمایشگاه برسندو بن ماری را در ۴۵ درجه تنظیم کرده و سپس یک ویال حاویLµ ۱۵۰۰ محیط LB فاقد آنتی بیوتیک را
نیز به بن ماری ۴۵ درجه منتقل می کنیم.
جذب DNA پلاسمید درnm 260 (بلانک با آب مقطری که پلاسمید در آن حل شده است ) میخوانیم.
– سلول های مستعد (سلول های کامپیتنت DH5α) را از فریزر۸۰ – خارج کرده وبر روی یخ قرار داده تا ذوب گردد سپس
سلول ها (DH5α) را به آرامی مخلوط کرده وLµ ۱۰۰ از آن با Lµ ۵ از پلاسمید (۱۰۰-۱ نانوگرم پلاسمید برای ۵۰
میکرولیتر سلول) در داخل میکروتیوب ml 5/1 استریل که کاملا در یخ فروبرده شده بود مخلوط گردید. بقیه سلولها به
۸۰ – منتقل شده . ویالهای حاوی سلول و پلاسمید برای ۴۵ دقیقه روی یخ مانده و سپس برای ۴۵ ثانیه به بن ماری ۴۲
درجه منتقل میشود- بعد از این مدت بلافاصله به مدت ۵ دقیقه روی یخ می گذاریم (شوک حرارتی). در این مرحله انتظار
داریم که پلاسمید وارد برخی از سلولها شده و در مخلوط سلولهای ترانسفورم شده داشته باشیم – سپسml1 محیط LB که
در بن ماری تا ۴۲ درجه گرم کرده بودیم به آن منتقل می کنیم و سپس به مدت ۳۰ دقیقه در دمای محیط قرار می دهیم. –
L µ۲۰۰-۱۰۰ از ویال حاوی سلولهای ترانسفورم شده را بر روی پلیت آگار حاوی آنتی بیوتیک کشت می دهیم و سپس به
مدت ۱ شبانه روز درون انکوباتور می گذاریم. چنانچه سلولها ترانسفورم شده باشند روی محیط دارای آمپی سیلین رشد

برای دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت  pipaf.ir  مراجعه نمایید.