پژوهش – جداسازی و تشخیص مولکولی پاراکوویروس های انسانی از نمونه کلینیکی کودکان مبتلا به …

۱-۳-۲)دانسیته:
کاردیو و آنتروویروس دانسیته ۳۴/۱ گرم در میلی لیتر در کلرید سزیم دارند و FMDV دانسیته ۴۵/۱ گرم در میلی لیتر در کلرید سزیم دارد. رینوویروس دانسیته ۴۰/۱ گرم در میلی لیتر در کلرید سزیم دارد که دلیل این اختلاف حرکت نفوذپذیری کپسیدویروس نسبت به سزیم است. کپسیدپولیو نسبت به سزیم غیر قابل نفوذ است و ویروس در چگالی شناوری سبک تری باند می شود ولی کپسیدآفتوویروسها منافذی دارد که سزیم می تواند به درون ویریون نفوذ نماید (۱۱و ۱۲و ۱۳).
(۳-۳-۱حساسیت نسبت به حلال های لیپیدی:
پیکورنا ویروس فاقد پوشش لیپیدی است و به کلروفرم، دتر جنت واتر مقاوم بوده و از بین نمی رود (۶ و ۱۴).
۱-۴) ساختمان پیکورناویروس:
(۱-۴-۱کپسید:
کپسید از چهار پروتئین ساختمانی به نام vp1 ، vp2 ، vp3 ، vp4 ، تشکیل شده است. ولی در میان اعضای پاراکوویروس ها استثناء می باشند. زیرا که کپسید آن ها تنها دارای سه پروتئین VPO ، VP2 و VP4 می باشد و کلیواژهایVPO، به VP2وVP4انجام نمیشود (۱۰).
در سال ۱۹۶۰ دو دانشمند به نام casper and klug مبنای ساختمانی ویروسها را تشریح کردند و نشان دادند که کپسید این ویروسها دارای ساختمان ایکوزاهدرال (Icosahedral )، تقارن بیست وجهی است که از چهار پروتئین VP4 – VP1 تشکیل شده (به استثنای پاراکوویروس) (۱۴). یک ۲۰ وجهی از ۲۰ مثلث متساوی الاضلاع و ۱۲ گوشه تشکیل یافته است (شکل ۱ ). نتایج حاصل از مطالعات اشعه X و بررسی های بیوشیمیایی نشان داد که کپسید پیکورنا ویروسها واجد ۶۰ پروتئین ساختمانی است که به صورت یک شبکه ۲۰ وجهی استوار یافته اند. در سال ۱۹۸۵ ساختار اتمی پولیوویروس و رینوویروس انسانی تیپ ۱۴ به کمک کریستالوگرافی با اشعه Xمشخص گردید (۱۵و۱۴).
شکل ۱- نمای شماتیک کپسید ویروسها.در این شکل حالت ۲۰ وجهی، پروتومرها و پپتیدهای شکل دهنده کپسید مشخص می باشد.شکاف کانیون (Canyon) نیز در گوشه سمت راست مشخص می باشد.
اصلی ترین جزء سازنده در کپسید پیکورنا ویروسها را پروتومر (protomer) نامیدند. هر پروتومر از ۴ پروتئین VP4–VP1 تشکیل شده است. سه پروتئین VP1، VP2 ، VP3 در سطح خارجی کپسید قرار دارند ولی VP4در سطح داخلی کپسید و در تماس با ژنوم قرار دارد. این پروتئین ها با هم شبکه ای استوانه ای را تشکیل داده که از ۸ رشته زنجیره موازی و در خلاف جهت هم قرار دارند و به نام -barreljellyrollβ می نامند (۱۶و۸) (شکل ۲).
این دومن یک ساختمان گوه ای شکل است که از دو روقه β موازی و در خلاف جهت هم ساخته شده اند یک ورقه β دیواره گوه را می سازد و ورقه دیگر که در مرکز قرار دارد، هم دیواره و هم کف گوه را شکل می دهد. گوه ای شکل بودن این ساختمان باعث فشرده شدن واحدهای ساختمانی شده و ایجاد یک پوسته سخت و فشرده را تسهیل می نماید. فشردگی دومن های β- barrel توسط شبکه ای از تداخلای پروتئین- پروتئین در روی کپسید داخلی بویژه در اطراف گوشه های ۵ ضلعی تقویت می گردد (۸و۱۶).
پروتئین های کپسید از نظر سکانس متفاوت و از نظر توپولوژی یکسان هستند و مهمترین تفاوت پروتئین های VP1، VP2 ، VP3در لوبهای صفحات بتا(β) و در قسمتهای انتهای آمینی (N- Terminal ) و انتهای کربوکسیلی (C- Terminal) می باشد. انتهای کربوکسیلی در سطح خارجی و انتهای آمینی در سطح داخل ویروس قرار دارد (۱۶).
دومن های β- barrelدقیقاً مشابه با ویروسهای گیاهی نظیر Southem bean mosaicوTomato bushy stunt می باشد. پروتئین های این دسته از ویروسها هیچ گونه همولوژی توالی با پیکورناویروسها ندارند. فرضیه ای که مطرح است این است که ۱- پلی پپتیدها از یک جد مشترکی تکامل یافته اند. ۲- دومن β- barrelیکی از محدود راههایی است که به پروتئین ها اجازه می دهد تا به فرم یک کره فشرده تجمع یابند (۱۸ و ۱۷).
(۲-۴-۱ سطح خارجی ویریون:
سطح ویریون پیکورناویروس های که شیاردار است و توسط یک شکاف عمیق بنام کانیون ( Canyon ) احاطه می گردد .
(۳-۴-۱ کانیون(Canyon):
پروتئین های VP3– VP1 شیارهای باریکی را تشکیل می دهند که کا نیون گویند. کانیون یک ناحیه بسیار فشرده و باریک است که مانع نفوذ عمقی مولکول های آنتی بادی می شود. در بعضی از پیکورنا ویروسها کانیون به عنوان محل اتصال به گیرنده عمل می کند مثل راینووپولیوویروس سطح آفتوویروس و کاردیو فاقد کا نیون است و ویریون آنها صاف تر از پیکورنا ویروس های دیگر است (۲۰) (شکل۳).
شکل ۲- دیاگرام شماتیک ۸ زنجیرهβ که ساختار گره ای شکل را بوجود می آورند.در اینجا لوپ هایی وجود دارد که رابطی بین ورقه های زنجیرهβ می باشد.این لوپ ها سطح ویریون را می پوشاند و به هر زیر واحد vp1-4 مورفولوژی و آنتی ژنیسیته ویژه ای می بخشند. در اکثر پیکورنا ویروس ها محل های آنتی ژنیک خنثی نوترالیزان در لوپ هایBC از VP1و VP3 یا لوپ EF درVP2 واقع شده اند.
شکل ۳- مدلی از پولیوویروس تیپ ۱- تاج ستاره ای شکل و ناحیه کانیون در اطراف آن مشخص است.
(۴-۴-۱سطح داخلی ویریون:
شبکه ای که توسط انتهای آمین پروتئین های کپسیدی در سطح داخلی ویریون شکل می گیرد و نقش آن در پایداری کپسید و ویریون می باشد. در تقارن چرخشی ۵ انتهای آمینی از ۵´ مولکول VP3 یک ورقه بتای موازی و سیلندری شکل را بوجود می آورند. این ساختار توسط پنج ورقه بتای سه زنجیره ای احاطه شده است. ارتباط بین این دو ساختار از طریق گروه میریستات ( Myristate) متصل شده به انتهای آمینی ازVP4برقرار می گردد (۴).
(۵-۴-۱نقش پاکت هیدروفوبیک:
در کف کانیون ناحیه ای بنام پاکت ( pocket ) وجود دارد که در این منطقه لیپیدهای مختلف قرار دارند و این پاکت در پوشش برداری ویروس نقش دارد و بعضی از داروهای ضد ویروسی روی این پاکت اثر و مانع از پوشش برداری ویروس می گردند (۲۰).
(۶-۴-۱ نقش میرستیک اسید:
در اغلب ویروسهای خانواده پیکورنا ویروس، اسید میریستیک توسط پیوندهای کووالانسی به اسید آمینه گلیسین در انتهای آمینی VP4 متصل می شود (۱۸). گروههای مریستیل سبب واکنش اسیدهای آمینه موجود در پروتئین VP3 و VP4شده و این مریستیه شدن در تجمع (Assembley) و پایداری کپسید نقش دارد(۱۹ ).
شکل ۴- تداخلات میریستات با پروتئنی های سطح ویروس.
۱-۵) ساختار ژنوم در پیکورنا ویروس ها:
ژنوم پیکورنا ویروسها بصورت RNA تک رشته با پلاریته مثبت ( +SSRNA) می باشد. این ژنوم عفونت زا بوده و پس از ترانسفکت نمودن سلول می تواند به پروتئین های لازم برای تکثیر ویروس ترجمه گردد. ساختار ژنوم شامل قسمتهای زیر می باشد.(شکل۵)
شکل ۵- تصویر شماتیک ژنوم پیکورنا ویروسها: در ابتدای ۵´ ژنوم پروتئین Vpgو بعد از آن ناحیه ۵´- UTR (بخش۵´ غیر کد کننده) واقع شده است. در انتهای ۳´ هم توالی ۳´-UTR و دنباله PolyAقرار دارد در بین این نواحی غیر قابل ترجمه بخش کد کننده پروتئین های ساختمانی P1 و غیر ساختمانی P2 / P3 واقع می شود. این توالی تنها در ژنوم کاردیوویروسها و آفتوویروسها مشاهده شده است.
( Vpg ) viral protein genome linked (1-5-1 :
در ابتدای ۵´ژنوم پیکورنا ویروسها، پروتئینی به نام Vpg قرار دارد (۲۱). در ژنوم همه پیکورناها Vpg وجود دارد ولی طول آن از ۲۲ تا ۲۴ اسید آمینه متفاوت است. Vpgبا پیوند کووالانسی به نیمه۵´یوریدیلات از RNA ی ویروسی توسط یک پیوند ۵´-۰-۴´یوریدنیل- تیروزین متصل می شود. معمولاً تیروزینی که به RNAویروس متصل می شود، سومین اسید آمینه از انتهای آمینی Vpo می باشد در همه پیکورنا ویروسها Vpgتوسط یک ژن منفرد( ۳B) کد می گردد، در حالیکه در FMDV سه ژن مسئول کد کردن Vpgهستند اگر Vpgرا از ابتدای ژنوم حذف کنیم عفونت زایی اختصاصی ویروس کاهش نمی یابد. Vpgفقط در RNAدیده می شود و در mRNAدیده نمی شود این پروتئین توسط Un linking enzyme سلول های میزبان از ژنوم برداشته می شود (۲۳و۲۲). تنها تفاوت بین RNAژنومی و mRNA پولیوویروس ، عدم وجود Vpgدر MRNAمی باشد. Vpgدر زنجیره RNA حد واسط و RNA زنجیره منفی وجود دارد و عنوان می گردد که احتمالاً Vpg به عنوان پرایمر در سنتز RNAدخالت داشته باشد (۲۴).
۵´- UTR(2-5-1 :
[۶](۵´- UTR) منطقه ای بلند و حاوی ۶۲۴ تا ۱۱۹۹ نوکلئوتید است که بعد از Vpg قرار دارد. این ناحیه در روند تکثیر و ترجمه ژنوم مؤثر است (۲۵).
IRES(3-5-1 :
در ۵´- UTR، ناحیه ای به نام [۷]IRES وجود دارد که حاوی ۲۴۰۰- ۲۱۰۰ نوکلئوتید است. ریبوزوم برای ترجمه به این قسمت چسبیده و سنتز پروتئین را شروع می کند. دو تیپ اصلی از IRESوجود دارد. این عناصر در جهت دهی عمل ترجمه دخالت می کنند. در آفتوویروس ها و کاردیوویروسها قسمت ۵´- UTRواجد یک ناحیه POLY (C)می باشد که تعداد بازهای آن ( ۸۰ تا ۲۵۰ نوکلئوتید در کاردیوویروسها و ۱۰۰ تا ۱۷۰ نوکلئوتید در آفتوویروسها ) متفاوت است. برخی از محققین طول بیشتر قطعه POLY (C)در کاردیو را مرتبط با ویرولانس بیشتر آنها در حیوانات می دانند (۲۵).
شکل۶: دو تیپ اصلی از IRESدر پیکورنا ویروسها: تصویر سمت چپ بخش ۵´- UTRپولیوویروس (تیپ I نامیده می شود و در انتروویروس ها و رینوویروس ها نیز دیده می شود) و تصویرسمت راست بخش ۵´- UTRانسفالومیوکاردیتیس ویروس تیپ II نام دارد و در آفتوویروسها و کاردیوویروسها مشاهده می شود) را نشان می دهد. ناحیه IRESدر داخل مستطیل مشخص می باشد. IRESهپاتو ویروسها با این دو شکل فرق دارند و برخی مقالات آنرا بعنوان تیپ سوم IRESمطرح می کنند.
(ORF) open Reading Frame(4-5-1 :

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت  ۴۰y.ir  مراجعه نمایید.