مقاله دانشگاهی – جداسازی و تشخیص مولکولی پاراکوویروس های انسانی از نمونه کلینیکی کودکان مبتلا به گاستروانتریت به روش …

بعد از ناحیه ۵´- UTR، ناحیه ORF قرار دارد که بعد از آلودگی توسط ویروس ORFبه یک پلی پروتئین بزرگ ترجمه شده و سپس توسط پروتئازهای ویروسی به ۱۱ تا ۱۲ پروتئین شکسته می شود و عملکرد آن جهت تهیه پروتئین های ساختمانی و غیر ساختمانی ویروس مورد استفاده قرار می گیرد.
۳´- UTR(5-5-1:
در پیکورنار ویروس ها ۳´- UTRکوتاه تر از ۵´- UTR می باشد. این ناحیه در رینویروسها ۴۷ نوکلئوتید و در EMCV بین ۱۴ تا ۱۲۵ نوکلئوتید طول دارد. در ناحیه ۳´- UTR[8]یک ساختار ثانویه بنام pseudo knot وجود دارد که سنتز RNA ویروس را کنترل می نماید (۲۶ و ۲۷).
Poly (A) (6-5-1 :
به انتهای ۳´ژنوم یک قطعه Poly (A)اتصال می یابد که طول متوسط آن از ۳۵ نوکلئوتید درEMCVتا ۱۰۰ نوکلئوتید در FMDV متغیر است و اگر دنباله Poly (A)حذف گردد عفونت زایی ویروس از بین می رود.
در پیکورنا ویروس ها، بخش کد کننده پروتئین های ساختمانی[۹] و غیر ساختمانی[۱۰] را به صورت p3, p2, p1مشخص می کنند. آفتو ویروس و کاردیوویروسها یک پروتئین رهبر[۱۱] (L) را قبل از قسمت P1کد می کنند. قسمت P1 ,پروتئین های ساختمانی را کد می کند ولی P2 و P3 پروتئین های غیر ساختمانی را کد می کنند. پروتئین های غیر ساختمانی در پردازش پروتئین های دیگر (۲A pro,3c pro, 3cd pro )و تکثیر ( ۲B, 2C, 3AB, 3B vpg, 3D pol ) مشارکت دارند (۱).
۱-۶) سیکل تکثیر پیکورنا ویروسها:
تکثیر به طور کامل به مدت ۱۰-۶ ساعت در سیتوپلاسم سلول آلوده به ویروس صورت می گیرد.
مراحل تکثیر به صورت خلاصه و به ترتیب عبارتند از:
۱-اتصال به رسپتور Attachment
۲- ورود و پوشش برداری Enterance and uncoating
۳- ترجمه ژنوم Translation and synthesis
۴- پردازش پلی پروتئین Polyprotein processing
۵- تولید ذرات جدید ویروسPyogen viruses
 
شکل ۷- چرخه تکثیر پیکورناویروس : ۱- اتصال به گیرنده ۲- مرحله پوشش برداری ۳- Vpg از ابتدای ژنوم حذف و سپس RNA ترجمه می گردد ۴- پلی پروتئین حاصل از ترجمه توسط پروتئازهای ویروسی به پلی پپتید مجزا کلیواژ می گردد. ۵- سنتز RNA بر روی غشاء وزیکول روی می دهد. ژنوم ویروس توسط RNAپلیمراز به RNAکامل زنجیر منفی (آنتی ژنوم) تبدیل می شود. ۶- از روی آنتی ژنوم تعداد زیادی RNAزنجیره مثبت ساخته می شود. ۷- این زنجیره های مثبت در ابتدای سیکل عفونت به پروتئین های مورد نیاز جهت تکثیر ویروس تبدیل می شوند و در اواخر سیکل عفونی به عنوان پروژنوم جهت تولید ویروس مورد استفاده قرار می گیرند. ۸و۹- مراحل اسمبلی و خروج ویروسها از سلول آلوده.
۱-۶۱-)اتصال Attacment :
پیکورنا ویروسها برای عفونت زایی نیازمند اتصال به غشاء سلول میزبان می باشد تا از این طریق داخل سلول میزبان گردد. این عمل توسط یک سری مولکولهای سطحی غشاء انجام می شود، این مولکولها از سال ۱۹۸۹ با شناخت رسپتورهای سطحی بر علیه پولیوویروس و رینوویروس تشخیص داده شدند (۲۸).
در زمینه رسپتورهای پیکورنا ویروس ها سه نکته مهم مشخص گردیده است:
الف) پیکورنا ویروس ها از رسپتورهای متفاوتی برای ورود به سلول استفاده می کنند.
ب) قسمتی از رسپتورها درون سلول قرار دارند مانند رسپتور کوکساکی ویروس B و A و انتروویروس .
ج) در بعضی از پیکورنا ویروس ها وجود یک رسپتور برای عفونت زایی ویروس کافی است ولی در بعضی دیگر نیاز به دو یا چند رسپتور است برای مثال، در کوکساکی ویروس A21 که رسپتور آن CD55 است برای ورود به درون سلول نیاز به [۱۲]ICAM-1 دارند (۲۹). بعضی از کوکسا کی ویروس های گروه B علاوه بر رسپتور CD55 از α V β۶ Integrinنیز به عنوان کورسپتور جهت اتصال به سلول استفاده می کنند (۴). بر اساس اینکه ویروس از کجا منشاء می گیرد ویروسهای مشخص به رسپتورهای سطحی متفاوتی متصل می شوند به طور مثال FMDV – A12 به اینتگرین α Vβ۳اتصال می یابد. ولی استرین O- FMDVکه به مدت طولانی در کشت سلولی رشد کرده است نمی تواند به این رسپتور متصل شود و بجایش هپاران سولفات به سطح سلول متصل می شود. استرین FMDV – A12نمی تواند سلولهای راکه فاقد β۶ Integrin α هستند را آلوده کند حتی اگر هپارین سولفات در سطح سلول باشد. این موضوع نشان می دهد که ویروس خود را در آزمایشگاه سازگار نکرده است و در نبود رسپتور اصلی, خود بتدریج قادر به استفاده از رسپتورهای دیگر شده است (۹).
(جدول ۲) گیرنده ها و کمک گیرنده های مورد استفاده در پیکورنا ویروس.
۱-۶۲-) مکانیسم اتصال به گیرنده های سطح سلولی:
کپسید پیکورنا ویروس از ۴ پروتئین تشکیل شده است که این پروتئین ها بصورت یک ۲۰ وجهی اسمبل می شوند در بین اعضای پیکورنا ویریده، پروتئین های کپسید بطور مشابه ای چیده می شوند (۷و۸).
در سطح کپسید پولیوویروس ها، رینو ویروس ها و کوکساکی ها یک شکاف بنام Canyon می باشد که در اطراف محور تقارن پنج وجهی قرار می گیرد. (شکل۸) ولی در کاردیوویروسها، آفتوویروسها و پاراکوویروسها Canyonوجود ندارد. این محل در پولیوویروس و رینوویروس، بعنوان جایگاهی برای تداخل با گیرنده های سلول می باشد و ایجاد موتاسیون در اسیدهای آمینه این ناحیه تغییراتی در افینیتی اتصال به گیرنده ها ایجاد می کند (۳۰و۳۱).
شکاف پیکورنا ویروس ها باریک و عمیق است و مولکولهای آنتی بادی می توانند به درون آن نفوذ نمایند (۳۱و۳۰).
داروهای ضد ویروسی مانند محصولات win جای لیپید را در کف کینون گرفته و به پاکت اتصال می یابند و مانع از اتصال ویروس به گیرنده های سلولی می شوند. اتصال این دارو به رینوویروس تیپ ۱۴ سبب تغییر شکل کنیون شده و مانع از اتصال به گیرنده های سلولی می شود. ولی اتصال دارو به رینوویروس تیپ های ۱A ، ۳ و ۱۶ و پولیوویروس سبب تغییرات ساختاری کمتری می شود (۳۲).
شکل ۸- تصویر شماتیکی از Canyonنحوه متصل شدن گیرنده ، آنتی بادی به ناحیه Canyon در VP1
شکل ۹- شکاف Canyonو نحوه قرار گرفتن دارو در VP1
در FMDV موتاسیون در توالی ) RGDآرژنین-گلایسین-آسپارتیک اسید)سبب ممانعت از اتصال ویروس به گیرنده سلولی می گردد ولی در کوکساکی ویروس۹A توالی RGD در ۱۷ اسید آمینه از انتهای کربوکسیی VP1واقع شده است و تغییرات در این توالی سبب عدم اتصال به گیرنده سلول نمی شود (۳۴).
ویروس هایی مثل کوکساکی ویروس ۹ Aو FMDV از طریق لوپ های سطحی خود به گیرنده های سلولی متصل می شوند. در FMDVتوالیRGDِ ( آرژنین- گلایسین- آسپارتیک اسید) در لوپ βG-βHاز پروتئین VP1کپسید قرار دارد و توسط گیرنده هایی از جنس اینتگرین شناسایی می شودو ویروس از طریق این گیرنده ها به سلول ها متصل می گردد (۳۳و۳۴).
۱-۶۳-)ورود به سلول و پوشش برداری ویروس:
پس از اینکه ویروس به گیرنده های سطح سلولی متصل شد باید پوشش برداری[۱۳] انجام شود و ژنوم ویروس به داخل سیتوپلاسم رها شده و در آنجا تکثیر می گردد که این عمل از طریق کاهش PH و یا فعالیت کمک گیرنده ها صورت می گیرد. به طور مثال در پولیوویروس بعد از اتصال به گیرنده PVr تغییرات اساسی در ساختار ویروس روی می دهد و پارتیکل های A بوجود می آیند و این پارتیکل ها تغییر شکل یافته و پروتئین داخلی VP4و انتهای آمینی VP1 را از دست می دهند. ذره A هیدروفوبیک است و بعد از اتصال به ممبران سلولی کانالی را برای عبور ژنوم به درون سیتوپلاسم سلولی ایجاد و RNA ویروس وارد سیتوپلاسم سلولی می شود (۳۶ و ۳۵) .
نظریات متفاوتی درباره مرحله دخول پیکورنا ویروسها وجود دارد یک نظریه بیان می کند که اتصال ویروس به گیرنده باعث تغییرات ساختمانی در ویریون می گردد در این حالت انتهای آمینی VP1 به طرف بیرون کپسید رانده می شود و در داخل غشاء سلولی نفوذ می کند و ایجاد سوراخ (Pore) در سطح غشاء سلول های آلوده ایجاد شده و RNA ویروس از این راه به درون سیتوپلاسم رها می گردد. (شکل ۵ و ۶) به عنوان مثال FMDVو رینوویروس بعد از اتصال به سلول سبب ایجاد اندوزوم در غشاء سلولی می گردد و توسط اندوسیتوز وارد سلول می شوند که در این ویروس (FMDV) پوشش برداری وابسته به PH است یعنی در PH معادل ۵/۶ کپسید ویروس جدا شده و RNAویروس آزاد می گردد (۳۸و۳۷).
شکل ۱۰)مدل دخول پیکورنا ویروس ها به درون سلول. پارتیکل های ۱۶۰ S به گیرنده های سطح سلول متصل می شوند .در دمای بالای ۳۳ درجه سانتیگراد تغییرات وابسته به گیرنده در آنها روی می دهد که منجر به تولید پارتیکل هایA (تغییر یافته) می شود . این ذرات هیدروفوب بوده , VP4 و انتهای آمینی از VP1 را از دست داده اند. مرحله Uncoating به دو طریق (غشای پلاسمایی یا غشای اندوزوم ها) صورت می کیرد و RNA ی ویروسی به درون سیتوپلاسم رها می گردد.
شکل ۱۱)ممکانیسم فرضی برای عبور RNA ی پیکورنا ویروسها از عرض غشا. (سمت چپ) اتصال ویروس به گیرنده را نشان می دهد. RNA در داخل کپسید قرار دارد و لیپید ها نیز درون پاکت هیدروفوب را می پوشاند. گیرنده نیز به کانیون (در بالای پاکت) متصل می شود .(سمت راست) تغیرات ساختمانی در کپسید روی می دهد. حرکت گیرنده در کانیون باعث خروج لیپید از پاکت می گردد و اجازه می دهد که تغییرات ساختاری در کپسید روی دهد. انتهای آمینی VP1 کشیده می شود و در داخل غشای سلولی منفذی ایجاد می کند که RNA از طریق آن به درون سیتوپلاسم رها می گردد.

برای دانلود متن کامل پایان نامه به سایت  fotka.ir  مراجعه نمایید.