دسته بندی علمی – پژوهشی : جداسازی و تشخیص مولکولی پاراکوویروس های انسانی از نمونه کلینیکی کودکان مبتلا …

محلول ۱% (حجمی حجمی) (Drethyl pyrocarbonate) DEPC قرار گرفتند و سپس اتوکلاو شدند.
محلول DEPC ترکیبی است که ساختمان پروتئینی آنزیمهای RNase و ساختار اسیدهای نوکلئیک را تخریب میکند لذا پس
از مجاورت وسایل پلاستیکی با آن لازم است برای جلوگیری از اثرات مخرب آن بر RNA، وسایل اتوکلاو شوند تا DEPCغیر فعال گردد..
(۲-۳مواد لازم برای تهیه سوسپانسیون:
ابتدا محلول های زیر تهیه و به طور جداگانه به مدت ۲۰ دقیقه اتوکلاو شدند.
محلول A:
(PH=7.4) PBS شامل NaCl (g8)، KCl (g2/.) ، Na2HPO4 (g 91/.) و KH2PO4(g 12/.) درml1000
محلول B‌: MgCl2.6H2O (g/100ml1/.)
محلول C: CaCl2 (g/100ml1/.)
برای تهیه محلول کار مورد نیاز ۱ حجم از محلول B با ۱ حجم از محلول C‌و ۸ حجم از محلول A مخلوط گردید. برای تهیه
سوسپانسیون از نمونه های مدفوع ۴ml از محلول کار با ۱ml کلروفرم در لوله فالکون ۱۵ ml مقاوم به کلروفرم مخلوط و
حدود، ۲ گرم مدفوع با سواپ به آن افزوده شد. لوله ها به مدت ۲۰ دقیقه روی شیکر قرار گرفتند و سپس به مدت ۱۵ دقیقه
در ۴°C با دور g 1500 سانتریفوژ شدند. محلول روئی حاوی ویروس بوده و ۲۰۰ ml از آن برای استخراج RNA به سرعت
به میکروتیوب ۱/۵ ml منتقل شد و بقیه نیز در فریزر°C -20 نگهداری گردید.
*RT-PCR:
با توجه به اینکه پاراکوویروس تیپ یک انسانی RNA ویروس است. بنابراین از روش RT-PCR استفاده گردید و پس از
جداسازی RNA از آن بعنوان الگو برای ساخت cDNA استفاده شده و ، cDNA‌تهیه شده برای تکثیر به روش PCR‌ به
میکروتیوب دیگری منتقل گردید. جزئیات در زیر توضیح داده شده است.
(۳-۳ جداسازی RNA و ساخت cDNA:
برای جداسازی RNA از محلول( RNXشرکت سیناژن باcat:RN7713C) که حاوی( guanidine salt وphenol solu. )میباشد به شرح زیر طبق پروتوکل کیت مربوطه استفاده شد :
در یک میکروتیوب ۱/۵ ml که حاوی ۲۰۰ μl از سوسپانسیون است ۸۰۰ μl محلول RNX اضافه کرده و به مدت ۱۵-
۱۰ ثانیه با دست تکان میدهیم. سپس به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق قرار داده و پس از آن ۲۰۰ μl کلروفرم به آن اضافه
کرده، ۳۰-۱۵ ثانیه به شدت آنرا تکان میدهیم و به مدت ۵ دقیقه در°C20- قرار داده، سپس در °C4 به مدت ۱۵ دقیقه با
دور ۱۲۰۰۰ g سانتریفوژ کردیم . بعد از سانتریفوژ محلول داخل میکروتیوب حاوی ۳ فازاست که فاز رویی فاز آبی بوده و
حاوی RNA است. فاز میانی بسیار نازک و حاوی قطعات تخریب شده ویروسی و فاز انتهایی که زرد رنگ است حاوی مخلوط
کلروفرم و محلول استخراج ویروس می باشد. فاز رویی را به آرامی به کمک سمپلر جدا میکنیم به نحوی که هیچ تداخلی با فاز
میانی پیدا نکند. حجم این بخش حدود ۸۰۰ μl است و به یک میکروتیوب استریل جدید منتقل میشود و هم حجم آن
ایزوپروپانول به آن افزوده میشود. برای تشکیل رسوب به مدت ۲-۱ ساعت در فریزر ۲۰°C- قرار می دهیم و سپس آنرا در°C
۴ درجه به مدت ۱۵ دقیقه با دور ۱۲۰۰۰ g سانتریفوژ میکنیم . محلول روئی را خالی کرده و ۵۰۰ μl اتانول ۷۰% اضافه
کرده و به مدت ۳ دقیقه با دور ۷۵۰۰ g در°C 4 سانتریفوژ می‌کنیم. در این مرحله رسوب RNA در ته میکروتیوب قابل
رویت است. الکل را خالی کرده و میکروتیوب را به صورت وارونه بر روی دستمال تمیز قرار میدهیم تا اتانول آن تبخیر شود
زیرا اتانول موجود در میکروتیوب در صورت عدم تبخیر موجب تداخل در مراحل PCR می شود. باید دقت کنیم که ضمن
خشک شدن الکل رسوب کاملا خشک نشود زیرا در میزان RNA آن نقصان ایجاد میشود. با توجه به اندازه رسوب موجود در
میکروتیوب μl25- 12 DEPC treated water به آن اضافه کرده وبه مدت ۱۰- ۵ دقیقه در بن ماری °C60- 55 قرار
می دهیم ( حرارت به باز شدن ساختارهای ثانویه احتمالی در RNA کمک میکند) و بلافاصله به یخ منتقل می کنیم تا
بسرعت وارد مرحله ساخت cDNA بشود. نگهداری RNA برای مدت طولانی فقط در فریزر°C80- امکان پذیر است.
(۴-۳سنتز cDNA:

برای دانلود متن کامل این پایان نامه به سایت  fumi.ir  مراجعه نمایید.